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Clemens J. - "MLDS: A Dataset for Weight-Space Analysis of Neural Networks". Arxiv 2021. Link

Clemens J. - "MLC@Home: A Distributed Platform for Studying and Understanding Neural Networks". Boinc Workshop 2021. Link

Valutazione attuale: 5 / 5

Il tool Blueprint
Questo articolo introduce un nuovo tool per Foldit: il pannello Blueprint visualizza la sequenza di aminoacidi e la struttura secondaria della vostra proteina. Per impostazione predefinita, ogni lettera della sequenza è colorata in base alle torsioni φ e ψ (angoli diedri) in quella posizione nella struttura, seguendo lo stesso schema di colorazione ABEGO utilizzato dalla mappa di Rama (Rama Map). Al di sopra della sequenza, uno schema di struttura secondaria riflette l'assegnazione di fogli e eliche ad ogni posizione. Il pulsante “Auto Struttura” rileverà i fogli e le eliche e creerà le appropriate assegnazioni della struttura secondaria.
Il pannello Blueprint è accompagnato dal pannello “Costruisci i blocchi” (BuildingBlocks). I blocchi di costruzione rappresentano schemi discreti della struttura centrale delle proteine, che possono essere applicati alla vostra struttura proteica. I blocchi di costruzione forniti qui corrispondono a congiunzioni specifiche che sono frequentemente osservate nelle proteine naturali (erano precedentemente note come "Congiunzioni Ideali" nella mappa di Rama). Tutti i blocchi di costruzione sono destinati a collegare direttamente elementi di una struttura secondaria, con un foglio o una elica da entrambi i lati: l’uso appropriato di un blocco di costruzione dipende da questo contesto secondario. Ad esempio, un blocco di costruzione elica-foglietto avrebbe una buona connessione tra una elica alla posizione 20 e un foglio nella posizione 23, ma non funzionerebbe bene se le posizioni tra spirale e foglio fossero invertite.

Basta cliccare e trascinare un blocco di costruzione nel pannello Blueprint per applicare il blocco di costruzione alla struttura: I blocchi di costruzione applicati rimarranno delineati nel pannello Blueprint. I blocchi costruttivi applicati continueranno a esercitare vincoli di torsione ovunque siano posizionati: questi vincoli si comportano come “elastici” per torsioni φ e ψ e cercheranno di mantenere i residui vicino alla forma originale del blocco di costruzione, ogni volta che si utilizza il tool “Wiggle”.
E’ sufficiente cliccare e trascinare un blocco di costruzione fuori dal pannello Blueprint per rimuovere il blocco di costruzione: questo rimuoverà anche i vincoli torsionali associati. E’ consigliabile lasciare i blocchi di costruzione e i vincoli torsionali mentre si continua a ripiegare la proteina. Il pannello “Costruzione blocco” contiene due blocchi di costruzione speciali accanto al menu contestuale: un blocco è tutta-elica ed un altro è tutto-foglietto. Questi speciali blocchi di costruzione possono essere collocati sul pannello Blueprint per formare residui in eliche ideali e fogli ideali (non esercitano vincoli torsionali e scompaiono immediatamente dopo l'applicazione).
Il pannello Blueprint sarà abilitato in puzzle di progettazione specifici: sarà accessibile dal menù “Azione” nell’interfaccia originale o dal menù principale nella Selezione Interfaccia.

Maggiori informazioni sul tool Blueprint

Questa sezione è stata aggiunta per rispondere ad una domanda di un giocatore:
È stato sottolineato che la rimozione dei vincoli dello strumento Blueprint verso la fine consente di migliorare notevolmente il punteggio. Stando così le cose, perché sembra “controintuitivo”? – gitwut

Prima di rispondere a questa domanda, vorremmo fare un piccolo approfondimento sul “dietro le quinte” dello strumento Blueprint.
Antefatto:
Ci sono due motivazioni dietro lo strumento Blueprint: il primo è, semplicemente, quello di rendere le "congiunzioni ideali" più accessibili ai giocatori. Il filtro “Congiunzioni Ideali” ha aiutato enormemente la progettazione di Foldit, e i recenti disegni top-score hanno tutti congiunzioni eccellenti. Tuttavia, sembrava che i giocatori avessero bisogno di fare molto lavoro per soddisfare quel filtro. Speriamo che lo strumento Blueprint abbia reso più facile (soprattutto per i principianti) soddisfare il filtro “Congiunzioni Ideali”.
La seconda motivazione per lo sviluppo dello strumento Blueprint è stato quello di fornire un processo di progettazione alternativo: alcuni di noi (amministratori) sospettano che cattive dorsali di Foldit siano il risultato di un ciclo aggressivo nelle strategie di gioco medio o tardo. Ad esempio, si supponga di progettare una proteina e si decida di formare congiunzioni alla fine: dal momento in cui crei le congiunzioni, puoi già “cementare” le tue eliche e i tuoi foglietti ed ottimizzare l’assemblaggio principale della tua proteina e, di conseguenza, la dorsale non avrà molta flessibilità per ricostruire le congiunzioni. I punti terminali di due fasce beta confinanti possono essere posizionati in modo tale che non ci sia una congiunzione stabile per collegarli: utilizzare in maniera “aggressiva”, il tool Rebuild/Remix, per forzare una unione tra punti terminali incompatibili è simile a martellare un piolo quadrato in un foro rotondo. Sarà impossibile chiudere  la congiunzione senza compromettere la geometria della dorsale. Avevamo sperato che lo strumento Blueprint potesse essere utilizzato all'inizio del processo di progettazione (per costruire rapidamente una bozza "sana" di un disegno), la quale progettazione potrebbe essere gradualmente ottimizzata senza compromettere la geometria della dorsale.

I vincoli di torsione nel “Costruisci i blocchi”.
Per rispondere alla domanda di Gitwut, i blocchi costruttivi includono i vincoli di torsione: questi vincoli forzano un residuo in una certa regione della mappa di Ramachandran —come gli elastici (che rappresentano i vincoli di distanza) forza due residui ad essere ad una certa distanza l’uno dall’altro. Quando i vincoli sono presenti, lo “scuotimento” non produrrà punti in maniera rapida, ma la soluzione cercherà di seguire i vincoli. In linea di massima, i vincoli permettono di reindirizzare lo scuotimento verso il risultato desiderato sacrificando, di solito, i guadagni a breve termine per trovare, in ultima analisi, un modello migliore.
Posizionare una congiunzione “BuildingBlock” sul pannello Blueprint introduce vincoli di torsione nei residui della stessa (altrettanto, la rimozione del BuildingBlock rimuove i vincoli): i vincoli di torsione sono destinati a preservare la congiunzione mentre un giocatore sviluppa il resto del suo disegno. I vincoli sono necessari in questo caso perché la funzione di energia Foldit non necessariamente favorisce questo tipo di congiunzioni (non capiamo ancora appieno, infatti, perché le congiunzioni di BuildingBlock siano così prevalenti nelle proteine naturali). Queste possono essere favorite per ragioni che non sono esplicitamente modellate nella cinetica di ripiegamento di Foldit o siano dovute ad effetti entropici più complessi (al contrario, le eliche e i foglietti sono naturalmente stabilizzati dalle forze del legame di idrogeno, che sono catturate dalla funzione di energia Foldit). Senza i vincoli di torsione, “scuotimento” è incline a cancellare la congiunzione BuildingBlock a favore di guadagni energetici più piccoli. Abbiamo inteso che i giocatori potessero mantenere i vincoli per preservare le congiunzioni BuildingBlock fino a quando un progetto in corso non si fosse risolto in una maturazione piuttosto avanzata, eliminando poi i vincoli per il perfezionamento del finale gioco.

Per rendere le cose ancora più complicate, osserviamo che abbiamo regolato manualmente come vengono applicati i BuildingBlocks tramite il pannello Blueprint: quando si trascina un BuildingBlock sul pannello Blueprint e lo scheletro della proteina si mette “in posizione”, questa forma iniziale "aggiustata" è solo una approssimazione della forma ottimale della congiunzione. Quando questa si attiva, i vincoli di torsione trascinano la dorsale nella sua forma ottimale, che può essere leggermente diversa dalla forma iniziale regolata (questo è particolarmente evidente per i blocchi β-fermaglio). Ciò è dovuto al fatto che le congiunzioni BuildingBlock sono derivate da proteine naturali, che non dispongono mai di eliche e foglietti perfettamente ideali. Se si dovessero applicare le congiunzioni ottimali di BuildingBlock ai fasci beta ideali di Foldit, i filamenti beta ideali non sarebbero allineati per formare legami di idrogeno (figura A, sopra). Per rendere il tool più user-friendly, abbiamo aggiustato i BuildingBlock ottimali in modo che le congiunzioni-fermagli siano compatibili con i foglietti ideali di Foldit. Quindi, una forcella di BuildingBlock inizialmente blocca due filamenti perfetti in un allineamento perfetto (Figura B); il successivo Wiggling permetterà che i fili beta si flettano leggermente, in modo che il loop BuildingBlock possa rilassarsi nella sua forma ottimale (Figura C).
Tra parentesi, alcuni astuti giocatori di Foldit hanno notato che la collezione BuildingBlocks manca di una β-forcella BAAB, che è un loop stabile spesso trovato in natura: questo loop induce una deformazione significativa dei filamenti beta adiacenti. Per quanto noi progettisti di Foldit abbiamo provato, non siamo riusciti a regolare il BuildingBlock BAAB, in modo che fosse ragionevolmente compatibile con i foglietti beta ideali di Foldit, e quindi quel particolare loop è stato omesso dalla collezione BuildingBlocks.

C’è un “percorso” per il ripiegamento naturale? – Bruno Kestemont
Questa è una eccellente domanda, ma sfortunatamente non esiste una risposta semplice. Il percorso di piegatura, talvolta discusso come "cinetica del ripiegamento", descrive come una proteina denaturata (struttura lineare) transita nella sua piega nativa (struttura tridimensionale) nel corso del tempo. In generale, i percorsi di ripiegamento sono poco compresi, ma questa è un’area di intensa ricerca (infatti, il nostro David Baker ha cominciato a studiare la cinetica delle proteine negli anni 90!). La maggior parte di noi che lavora con Foldit o Rosetta non pensa molto ai percorsi di ripiegamento (come ha detto un collega, "A chi interessa?"): sosteniamo fortemente l'ipotesi che una catena di aminoacidi avrà naturalmente la sua struttura energetica più bassa (vedi il dogma di Anfinsen) e non ci preoccupiamo troppo del percorso necessario per arrivarci. In altre parole, siamo più interessati a come un sistema proteico si comporti in equilibrio; come il sistema raggiunga esattamente l’equilibrio è un’altra questione.
Teoricamente:
La maggior parte delle persone concorda sul fatto che le interazioni forti, locali (ad esempio i legami idrogeno a corto raggio che stabilizzano le alfa-eliche) si formeranno e che, invece, le interazioni deboli, non locali si formeranno più lentamente (esempio, l’abbinamento di filamenti beta tra residui distanti).
Sperimentalmente:
Molte piccole proteine sembrano piegarsi attraverso un meccanismo concertato, a due stati: si potrebbe immaginare che una proteina sia tradotta completamente dal ribosoma e che esista, per breve tempo, come una “bobina casuale” in soluzione prima di piegarsi tutta in una volta in una piega stabile. Noi osserviamo tali proteine in soli due stati: completamente dispiegate o completamente ripiegate. Questo è lo scenario più probabile per i tipi di piccole proteine (<150 residui) che si incontrano nei puzzle di Foldit.
Le proteine più grandi sembrano seguire vie più complesse, con percorsi multi-stato. In alcuni casi, possiamo osservare popolazioni multiple di proteine che esistono in vari, discreti stati di “pieghevolezza”. Molte di queste proteine si piegano anche in co-traslazione nella cellula, in modo che il N-terminale della proteina possa essere completamente piegato prima che il ribosoma finisca traducendo il C-terminale.

Valutazione attuale: 5 / 5

Fin dal nostro ultimo post, abbiamo condotto un esperimento di diffrazione a raggi-X con uno dei nostri cristalli proteici. Siamo stati fortunati che i cristalli di proteine hanno prodotto dati di diffrazione di alta qualità e che, da questi dati, siamo riusciti a risolvere la prima struttura in cristallo di una proteina progettata dai giocatori di Foldit: una corrispondenza quasi esatta alla struttura progettata! Di seguito spieghiamo un po' di più sulla diffrazione a raggi X, mentre in un post successivo esamineremo più dettagliatamente la struttura finale.
Per prima cosa, il cristallo proteico viene raccolto dalla goccia usando un piccolo anello di nylon, di circa 0,3 mm di diametro. I cristalli di proteine sono spesso molto fragili, per cui “prendere al lazo” il cristallo richiede una mano costante (come, per esempio, nel dosaggio ottimale del caffè). Anche nell’asola, il cristallo è ancora immerso nella soluzione acquosa, con la tensione superficiale che contribuisce a mantenere il cristallo nell’asola. L’asola viene rapidamente sommersa in azoto liquido, ad una temperatura di circa -200 ° C, che spegne la maggior parte del movimento termico delle molecole nel cristallo.

Una volta congelato, il nostro cristallo è montato su un braccio robotico che posiziona il ciclo nel percorso a raggi X. Durante l'esposizione ai raggi X, il cristallo viene mantenuto sotto un flusso costante di azoto liquido per limitare l'aumento della temperatura nel cristallo: i raggi X hanno un'elevata energia e solo così, con il freddo, un cristallo di proteine può sopportare così tanta esposizione ai raggi prima di cominciare a degradarsi. Il reticolo della proteina potrebbe disintegrarsi a causa dell'aumento del movimento termico delle singole molecole proteiche, oppure i raggi X potrebbero innescare reazioni chimiche all'interno della proteina, distorcendo la sua struttura.
I raggi X sono, semplicemente, un tipo di radiazione elettromagnetica con una lunghezza d'onda molto breve - in questo caso circa un angstrom. In un esperimento di diffrazione a raggi X, è importante che tutte le radiazioni abbiano esattamente la stessa lunghezza d'onda e si concentrino in un fascio molto stretto. Con il nostro cristallo montato nel percorso del fascio a raggi X, un rivelatore di raggi X è posizionato dietro il cristallo e misura i raggi incidenti dopo questi hanno colpito il cristallo e sono diffratti dagli elettroni delle molecole proteiche. A causa della disposizione regolare degli atomi nel cristallo proteico, i raggi X diffratti subiscono interferenze “costruttive” in particolari direzioni: questo si verifica quando due "fette" equivalenti del cristallo sono orientate per coincidere con la lunghezza d'onda dei raggi X. Ovunque si verifichi un'interferenza costruttiva, il rilevatore registra un segnale particolarmente intenso, mostrato come punto scuro sull'immagine qui sotto; presi insieme questi punti comprendono un modello di diffrazione.

Questo sopra è un modello di diffrazione di raggi X di un cristallo proteico. Nell’inserto a destra, possiamo vedere che alcuni punti sembrano avere dei duplicati che sono leggermente deviati: questo indica che ci sono attualmente due cristalli identici nel percorso del raggio, orientati in maniera leggermente diversa. Molto probabilmente, il cristallo si è “fratturato” in due durante il congelamento (fortunatamente il software di elaborazione delle immagini che utilizziamo è abbastanza sofisticato da correggere questo problema).
La distanza e la posizione dei punti è governata dalla dimensione e dalla forma della “cellula unitaria” del cristallo, l’unità ripetuta che costituisce il cristallo. L'intensità di ogni punto è determinata dalla distribuzione degli elettroni all'interno della cellula unitaria (cioè le posizioni degli atomi nella proteina). Ogni atomo della cellula unitaria contribuisce ad ogni punto nello schema di diffrazione. Se si potesse cambiare la densità degli elettroni intorno ad un solo atomo della proteina cristallizzata, questo cambierebbe l'intensità di ogni punto nel modello di diffrazione!
Si noti che le macchie più lontane dal centro del rivelatore tendono ad essere meno intense: i punti più lontani contengono dati di maggior risoluzione circa la densità elettronica della proteina. Se aggiustiamo il contrasto di questa immagine, si possono individuare macchie vicino al bordo del rivelatore: questa proteina diffrange i raggi X ad una risoluzione limite di 1,2 amstrong! In una mappa di densità di elettroni derivata da questi modelli di diffrazione, dobbiamo essere in grado di distinguere le posizioni di singoli atomi.

Se il cristallo viene ruotato rispetto al fascio a raggi X, si osserverà un altro modello di diffrazione, poiché un nuovo orientamento produce interferenze costruttive in direzioni diverse. Di solito misuriamo un nuovo modello di diffrazione a intervalli di rotazione di 0,5 gradi, eventualmente ruotando il cristallo per un totale di 180 gradi (a volte meno per cristalli altamente simmetrici) al fine di raccogliere un set di dati completo. Questo set di dati è stato raccolto con un rivelatore all'avanguardia che può misurare i singoli fotoni; la raccolta di un set di dati completo non richiede più di qualche minuto. Nei "primi giorni" della cristallografia delle proteine (gli anni 60), per raccogliere un set di dati completo poteva richiedere un intero giorno!
La lavorazione e l'interpretazione di questi modelli di diffrazione dei raggi X è una procedura complessa e molto tecnica, e non lo approfondiremo qui. Ma sia sufficiente dire che i dati di diffrazione dei raggi X hanno rivelato una struttura cristallina piena e ad alta risoluzione di questa proteina progettata dai giocatori di Foldit!

Congratulazioni a Waya, Galaxie, e Susume che hanno contribuito alla soluzione del Puzzle 1297! Tutti i giocatori dovrebbero controllare Puzzle 1384 per esplorare la raffinata mappa di densità elettronica da questi dati e vedere se è possibile ripiegare la sequenza proteica nella sua struttura di cristallo! Faremo seguire, poi, un confronto più dettagliato del modello progettato e della struttura cristallina finale.

Rimescolare e inserire Frammenti
Inserimento frammenti
Un Frammento è un modello per un pezzo della dorsale proteica e può essere di qualsiasi dimensione. Un frammento di dimensione 3 sarà una forma per 3 residui, uno di 9 per 9 residui.  Quando si inserisce un frammento, si copia la forma di quel frammento in un pezzo della dorsale: pensatelo come ad un copia/incolla di un pezzo sulla dorsale. Qui sotto si possono vedere 3 diversi frammenti (in turchese) che sono stati copiati dallo strumento Remix sulla dorsale.

La collezione di frammenti che si copiano/incollano viene chiamata libreria di frammenti: vorremmo che la nostra libreria di frammenti fosse riempita con i migliori frammenti possibili - frammenti di cui noi siamo fiduciosi sono buone forme che daranno alle nostre pieghe le maggiori probabilità di successo.
Quindi, da dove viene la nostra libreria? Spesso il miglior approccio al ripiegamento proteico (o a qualsiasi altra cosa, in realtà) è prendere qualcosa che funziona e riutilizzarlo.  Abbiamo migliaia di proteine dalla natura, di cui conosciamo la forma e siamo certi che queste forme funzionano perché ne abbiamo le prove fisiche. Osservando queste forme note, possiamo cercare frammenti comuni in molte di queste proteine naturali: prendiamo questi frammenti e ci costruiamo la nostra libreria. Poi, quando qualcuno ha bisogno di una forma per una sezione di dorsale, guardiamo nella nostra libreria e troviamo frammenti che possiamo copiare/incollare nella nostra proteina. Lo strumenti che fa questa ricerca e il copia/incolla si chiama “raccoglitore di frammenti” (fragment picker).

Il "raccoglitore di frammenti" di Foldit
Lo strumento Ricostruire (Rebuild) è stato il primo ed originale raccoglitore di frammenti, prendendoli da una libreria di frammenti di dimensione 3: quando si utilizza lo strumento su un pezzo della dorsale, lui sceglie un sotto-pezzo della dimensione 3 all’interno della selezione, controlla un frammento e lo copia/incolla nella proteina.
Ci sono, però, due problemi con questo strumento. Il primo è che, avendo solo frammenti di dimensione 3, se si vogliono frammenti più grandi bisogna combinare tra di loro vari frammenti piccoli, cosa che, scientificamente, è meno valida. Il secondo (e più grande) problema è che lo strumento Ricostruire non è molto preciso su quali forme scegliere: è sufficiente chiedere frammenti di dimensione 3 e lo strumento li fornisce*. Poi lo strumento è costretto a fare molto lavoro dietro le scene per cercare di rendere inseribili i frammenti nella sezione stabilita.
Qui si possono vedere i frammenti reali che Rebuild sta cercando di inserire (nessun “dietro le quinte” sta lavorando per renderlo adatto) mettendo un punto di taglio ad un'estremità della selezione e disattivando le forze del punto di taglio. Si guardi al risultato qui sotto:

Come si può vedere, questi frammenti non si adattano molto bene. La banda blu rappresenta il divario tra dov’è l’endpoint e dove dovrebbe essere in realtà. L'unico modo per renderli "in forma" richiede di distruggere il frammento originale nel processo.  Lo strumento Remix cerca di risolvere entrambi questi problemi. In primo luogo la biblioteca di frammenti ha frammenti di dimensioni da 3 a 9. Secondo, e più importante, quando si chiede un frammento con Remix, lui cerca un frammento che si inserisca in maniera naturale tra le estremità della selezione.
Ecco alcuni risultati di Remix senza nessuna modifica dopo l’inserimento:

Tutti questi frammenti sono adatti: la fascia gialla mostra che il punto di taglio è già abbastanza vicino da poter essere chiuso. In realtà, abbiamo ancora "corretto" i frammenti di Remix, ma ora hanno solo bisogno di un piccolo aggiustamento, quindi il frammento è lasciato praticamente intatto.
Questo significa che il tool è molto migliore nel lasciare i giocatori con frammenti scientificamente validi.
*Il Rebuild prende la sequenza della dorsale e della struttura secondaria quando si effettua una ricerca, ma non sono disponibili informazioni sulla conformazione.

Usare il nuovo Remix - Mescolare attraverso l’interfaccia grafica
Per usare il Remix su un pezzo di dorsale, selezionare il pezzo e cliccare il bottone Remix (o, nell’interfaccia originale, click con il pulsante destro e poi cliccare sul bottone Remix – apparirà il popup dell’interfaccia Remix).

Si osservi l’interfaccia qui sopra. Innanzitutto ci sono le frecce destra e sinistra: queste permettono di passare attraverso i vari frammenti che Remix ha trovato per questa selezione. E’ possibile vedere quale frammento si sta osservando nella casella di testo sotto i pulsanti. Il primo frammento è sempre quello con cui si parte prima di usare lo strumento Remix e non cambierà nulla della struttura.
Il pulsante di stop serve per accettare il frammento attualmente visualizzato. È inoltre possibile utilizzare il pulsante di arresto nell'angolo superiore sinistro dello schermo e avrà lo stesso effetto.
Accanto al testo che mostra quale frammento si è selezionato, è possibile vedere un punteggio: questo punteggio permette di farsi una idea del punteggio dei frammenti senza dover chiudere lo strumento e scuotere la selezione. Occorre ricordare che questa è solo una stima approssimativa, ed è utile per un confronto relativo dei risultati: il punteggio finale, probabilmente, sarà diverso da quello visualizzato qui.
Infine abbiamo il pulsante “Più”: questo darà l’accesso alla funzionalità di salvataggio. Quando premuto, comparirà questo messaggio.

Dopo aver salvato, si può premere il bottone per tornare al frammento: premendo il pulsante “Più” per un ulteriore frammento, darà la possibilità di un salvataggio veloce nello slot, sovrascrivendo quello esistente. E’ possibile anche premere il pulsante “Stop”(che ha sostituito il “Più”) per cancellare il salvataggio veloce.

Quando si hanno tutti i frammenti desiderati, premere “Stop” e questi frammenti saranno disponibili nello slot per il salvataggio veloce. Cliccare Ctrl-1 e Ctrl-8 per avere accesso.

Rimescolamento via Script
Lo strumento può essere usato anche via scripts. Ecco un breve tutorial di come usarlo:
Per avviare la funzione, usare il comando

structure.RemixSelected(start_quicksave, num_results)

Quando si esegue questa funzione, verrà rimescolata la vostra selezione e posizionata fino al num_results dei diversi risultati nello slot di salvataggio veloce, cominciando uno slot start_quicksave: questo restituirà il numero di risultati che erano stati inseriti (dei volontari ci hanno fatto notare che li avrebbero voluti visibili).
Un esempio:

print(structure.RemixSelected(5, 3))

Se ci sono 3 o più risultati, stamperà “3” e collocherà il risultato negli slot di salvataggio veloce 5,6 e 7. Se ci sono due risultati disponibili, stamperà “2” e il risultato sarà solo negli slot 5 e 6.

Consigli generali
La raccolta di frammenti è utilizzata nel miglior modo per individuare i loop della proteina. Le forme del loop variano molto di più rispetto ad altre strutture secondarie, e quindi trovare un buon loop è più difficile e l'utilizzo di frammenti effettivi da proteine reali diventa più importante.
In generale è meglio usare frammenti più grandi, dal momento che questo offre un pezzo di buona dorsale migliore in una maniera che molti più piccoli rimescolamenti non riescono. Non si faccia troppo affidamento nel punteggio stimato mostrato nell'interfaccia utente Remix: le differenze di meno di 100 punti non sono molto significative.
Nel caso in cui lo strumento non trovi nulla, provare a selezionare un residuo in più o uno in meno in entrambi i lati della selezione: spesso questa mossa sarà sufficiente per dare una migliore gamma di risultati. E’ abbastanza facile farlo nella Interfaccia Selezione, ma richiede che siano riassegnati alcune strutture secondarie nell’Interfaccia Originale.
Alla fine, dopo aver inserito un frammento, ogni cambiamento alla sezione allontanerà dal frammento: è meglio trovare un frammento che richiede modifiche minime al progetto finale.