Scienza e ricerca

I giocatori entrano nel laboratorio
La scorsa settimana il laboratorio del Baker ha ordinato materiali per costruire l'ultima serie di disegni Foldit in laboratorio per sperimentazioni sperimentali! I seguenti design proteici sono stati selezionati in base all’ispezione visiva dei nostri scienziati e alle previsioni di ripiegamento dal progetto Rosetta@Home.
Per ogni progetto qui sotto abbiamo incluso, a sinistra, l’immagine creata dal giocatore di Foldit; a destra l’imbuto pieghevole con l’energia e l’RMSD del C-alfa per 100 mila secondi sulle previsioni di Rosetta@Home (in rosso), nonché l’immagine della previsione dell’energia più bassa. Ci piace vedere che la previsione dell’energia più bassa ha anche un basso RMSD.

Design di Monomeri
Nel design di monomeri, siamo particolarmente interessati alle diverse topologie contenenti alcuni foglietti beta come strutture secondarie. Queste topologie sono notevolmente più difficili da progettare rispetto ai fasci elicoidali che hanno avuto successo in passato.
Di conseguenza questi imbuti di ripiegamento possono apparire meno puri, ma siamo comunque entusiasti per la sperimentazione in laboratorio!

Design di oligomeri simmetrici
Per la progettazione di omo-oligomeri simmetrici, facciamo una analisi simile per essere sicuri che il monomero si ripieghi come aspettato. Vogliamo anche assicurarci che, una volta ripiegate, le unità monomero si leghino, probabilmente, tra di loro nell'orientamento corretto. Il motivo più comune per cui un progetto non riesce a fare questo test "di ripiegamento" è che la sua interfaccia è completamente idrofobica e priva di caratteristiche. In questo caso, due monomeri opportunamente piegati possono unirsi in diversi modi per coprire la stessa quantità di superficie idrofoba. Il modo migliore per assicurare il legame specifico nell'orientamento corretto è quello di progettare superfici robuste e
complementari (ad esempio grandi catene laterali interdigitate) e, poi, incorporare reti di legami-idrogeno nell'interfaccia.
I seguenti progetti simmetrici sono stati eseguiti in maniera sufficiente per entrambi i test di ripiegamento e docking  dei monomeri (dati non visibili) e siamo ansiosi di provarli – tuttavia pensiamo ci sia ancora spazio per miglioramenti nella progettazione di interfacce specifiche!

I giocatori responsabili dei disegni qui sopra meritano certamente un riconoscimento, ma ci sono vari disegni molto più emozionanti che sono ancora in fase di analisi. Non vediamo l'ora di vedere cosa i giocatori di Foldit riusciranno a far uscire con il prossimo aggiornamento!

Miglioramenti nel design delle proteine in Foldit - Rosetta@Home

Come alcuni di voi sanno, dopo aver chiuso un puzzle, sottoponiamo una selezione dei risultati dei giocatori di Foldit al progetto di calcolo distribuito Rosetta@Home. Rosetta@home distribuisce queste sequenze a migliaia di computer nel mondo, cosicché ciascun computer può calcolare una previsione di come la sequenza di amminoacidi possa ripiegarsi. Questo enorme set di dati delle strutture previste ci dice molto riguardo la debolezza del processo di design, rendendo questo il test a disposizione più rigoroso per convalidare i risultati prima di costruire le proteine effettive in laboratorio.
I diagrammi qui sotto mostrano i set di dati di Rosetta@home riferiti a due puzzle di monomeri su Foldit. Ogni puntino rosso rappresenta una differente struttura predditiva ed è posizionata secondo la sua RMSD (deviazione quadratica media) nella posizione Cα (acidi carbossidici), vicino allo 0 significa vicino alla struttura progettata) e il suo punteggio (che è l’energia potenziale calcolata; punteggio più basso indica struttura più stabile). Quello che vorremmo vedere è un “imbuto” che corre da in alto a destra a in basso a sinistra di ciascuna trama: questo significherebbe che una previsioni diverse da quella progettata sono instabili e che le previsioni più simili sono più stabili.

L’immagine più in alto delle quattro rappresenta la miglior soluzione del puzzle 798  (maggio 2013): si noti che la previsione più vicina ha un RMSD > di 2 Angstrom,
il che significa che nessuna previsione è vicina alla struttura progettata. Inoltre le previsioni più vicine non erano nemmeno le migliori come punteggio: la previsione ad energia più bassa per questa struttura ha un RMSD di 7 Angstrom, rappresentando una piega completamente diversa.
Le tre immagini seguenti rappresentano le tre migliori soluzioni del puzzle 854 (maggio 2014): ognuna di queste mostra l’energia più bassa con un RMSD < 1 Angstrom dalla struttura progettata – un risultato incredibile (il primo imbuto dei tre è il più forte di tanti che abbiamo inviato al laboratorio Baker).
Forse, ancor più eccitante della qualità di questi imbuti di ripiegamento è il fatto che essi sono derivati dalle migliori soluzioni Foldit, mentre nei precedenti puzzle gli scienziati del laboratorio erano stati in grado di identificare solo design di scarsa qualità che ripiegavano meglio delle soluzioni migliori. Questi sono risultati veramente emozionanti e un lotto di progetti dal puzzle 854 sono state rapidamente inviate al laboratorio di produzione.
Stiamo ancora lavorando per ridurre le dimensioni del client e per ottimizzare questi tools per essere i più efficienti possibile. Allo stesso modo ci sono molti miglioramenti da fare dal lato dei giocatori di Foldit (ci piacerebbe vedere più progetti di foglietti beta (ci stiamo lavorando….Foldit è intrinsecamente propenso verso le Alfa-eliche, così è una piccola "battaglia" quella di migliorare i foglietti Beta).

La storia del design proteico in Foldit

Come discusso in un precedente post , alcune soluzioni dei giocatori di Foldit ricavate da un puzzle sono state scelte per la sintesi nel laboratorio Baker. Un design in particolare, dal puzzle 854, ha recentemente prodotto alcuni risultati promettenti nel “laboratorio umido”. Qui sotto seguiamo il processo di test.

1. Una volta selezionato il design da sintetizzare in laboratorio, ne estraiamo la sequenza di aminoacidi e ne facciamo una trascrizione inversa in una sequenza di basi DNA (un gene, per esempio), aggiungendo un “tag” speciale che ci sarà utile più avanti.

2. Noi ordiniamo questo gene come una molecola di DNA da un gruppo di sintesi del gene, e uniamo il gene in un pezzo circolare più grande del DNA chiamato plasmide. Il plasmide, che ora contiene il nostro gene, è inserito nei batteri E. coli, che possiamo far crescere e riprodursi in un incubatore. Questi batteri trascrivono e traducono il nostro gene come se fosse uno dei loro, producendo il nostro design come una catena di polipeptidi; se il disegno della proteina è “buono”, la catena del polipeptide si ripiegherà naturalmente nella struttura di progettazione.
3. Una volta che i batteri sono cresciuti fino alla saturazione e producono una grande quantità di proteine, “apriamo” le cellule batteriche e separiamo la nostra proteina da quelle dell’E.Coli, usando il tag speciale che abbiamo inserito nel passaggio 1. A questo punto, possiamo vedere se i batteri sono stati in grado di produrre la nostra proteina e se essa è solubile. Le proteine non strutturate, di solito, saranno degradate dall’E. Coli o saranno in forma insolubile.

SDS-PAGE. Un campione di proteine mescolate (blu colorato) viene passato attraverso un gel di poliacrilamide dall'alto verso il basso, in modo che le proteine più piccole si muovano più velocemente attraverso il gel. Qui sono mostrati tre campioni: tutte le proteine solubili da un batterio (sinistra), proteine che non hanno il tag speciale che abbiamo inserito nello step1 (in mezzo) e le proteine con il tag speciale (destra). Anche se i primi due campioni hanno molte bande (diverse proteine) che si diffondono lungo la lunghezza del gel, il campione a destra è “dominato” da una singola grande macchia (la nostra proteina) vicino alla parte inferiore del gel.

4. Usiamo la cromatografia di esclusione molecolare (SEC), che separa le proteine in base alla loro dimensione, per liberarsi di altre impurità proteiche. Questo passaggio ci fornisce anche informazioni sullo stato oligomerico delle nostre proteine (le proteine instabili con residui idrofobici esposti tendono ad auto-associarsi in oligomeri). I monomeri strutturati si comporteranno in modo diverso sulla colonna rispetto agli oligomeri o agli aggregati non strutturati.

Traccia SEC. Le proteine sono fatte passare attraverso una matrice tale che le proteine più grandi percorrano più velocemente la stessa, e vengano “raccolte” prima (all’estremità sinistra dell’asse delle x); l’assorbanza dei raggi UV è usata per misurare la concentrazione proteica (asse delle y) dei campioni così come vengono raccolti. E’ possibile notare che, nel caso della nostra proteina, questo passaggio non fosse strettamente necessario, dal momento che la proteina era insolitamente pura, evidenziata da un solo picco dominante a 14ml. Infatti, il posizionamento a 14ml corrisponde esattamente alla dimensione prevista dal design, indicando che la proteina è monomerica.

5. Dopo aver purificato la nostra proteina, possiamo usare il dicroismo circolare (CD) per misurare la sua struttura secondaria. Questa tecnica misura l’assorbimento, da parte di una proteina, della luce polarizzata circolarmente e può dirci, all’incirca, la quantità di α-eliche o di β-foglietti in una proteina. Questa misura, inoltre, permette di monitorare come la proteina si dispieghi con l’aumentare della temperatura.

Dicroismo Circolare. Differenti elementi della struttura proteica interagiscono in maniera diversa con la luce polarizzata circolare. A 25 gradi centigradi (traccia blu, in alto) la nostra proteina mostra un DC tipico di una proteina con un notevole contenuto di α-eliche. A 95 gradi (traccia roda, in alto), la forma del profilo è meno evidente, ad indicare una perdita di struttura secondaria; struttura secondaria che viene “recuperata” tornando a 25 gradi (traccia verde, in alto). La traccia inferiore mostra come il segnale del DC a 220 nm cambi quando viene aumentata la temperatura del campione proteico. Il passo graduale di questa traccia indica uno sviluppo non cooperativo e multi-stato.

La proteina sopra è in fase di preparazione per la cristallizzazione. Se riuscisse, potremmo ottenere una struttura cristallina ad alta definizione della proteina e fare un confronto con la proteina progettata.

Pubblicazioni

Scienze Cognitive

(Cognitive science)

Mind Modelling

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Moore L. R., Gunzelmann G. - "An interpolation approach for fitting computationally intensive models". Cognitive Systems Research 19, 2014. Link

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Moore L.R. - "Cognitive model exploration and optimization: a new challenge for computational science". Computational and Mathematical Organization Theory 17(3), 2011. Link

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Moore L.R., Kopala M., Mielke T. et al. - "Simultaneous performance exploration and optimized search with volunteer computing". 19th ACM International Symposium on High Perfomance Distribuited Computing, 2010. Link

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Harris J. - "MindModeling@Home: a large-scale computational cognitive modeling infrastructure". CSER 2008. Link

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Gluck K., Scheutz M. - "Combinatorics meets processing power: Large-scale computational resources for BRIMS". 16th Conf Behaviour Rappresentation, 2007. Link