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Rimescolare e inserire Frammenti
Inserimento frammenti
Un Frammento è un modello per un pezzo della dorsale proteica e può essere di qualsiasi dimensione. Un frammento di dimensione 3 sarà una forma per 3 residui, uno di 9 per 9 residui.  Quando si inserisce un frammento, si copia la forma di quel frammento in un pezzo della dorsale: pensatelo come ad un copia/incolla di un pezzo sulla dorsale. Qui sotto si possono vedere 3 diversi frammenti (in turchese) che sono stati copiati dallo strumento Remix sulla dorsale.

La collezione di frammenti che si copiano/incollano viene chiamata libreria di frammenti: vorremmo che la nostra libreria di frammenti fosse riempita con i migliori frammenti possibili - frammenti di cui noi siamo fiduciosi sono buone forme che daranno alle nostre pieghe le maggiori probabilità di successo.
Quindi, da dove viene la nostra libreria? Spesso il miglior approccio al ripiegamento proteico (o a qualsiasi altra cosa, in realtà) è prendere qualcosa che funziona e riutilizzarlo.  Abbiamo migliaia di proteine dalla natura, di cui conosciamo la forma e siamo certi che queste forme funzionano perché ne abbiamo le prove fisiche. Osservando queste forme note, possiamo cercare frammenti comuni in molte di queste proteine naturali: prendiamo questi frammenti e ci costruiamo la nostra libreria. Poi, quando qualcuno ha bisogno di una forma per una sezione di dorsale, guardiamo nella nostra libreria e troviamo frammenti che possiamo copiare/incollare nella nostra proteina. Lo strumenti che fa questa ricerca e il copia/incolla si chiama “raccoglitore di frammenti” (fragment picker).

Il "raccoglitore di frammenti" di Foldit
Lo strumento Ricostruire (Rebuild) è stato il primo ed originale raccoglitore di frammenti, prendendoli da una libreria di frammenti di dimensione 3: quando si utilizza lo strumento su un pezzo della dorsale, lui sceglie un sotto-pezzo della dimensione 3 all’interno della selezione, controlla un frammento e lo copia/incolla nella proteina.
Ci sono, però, due problemi con questo strumento. Il primo è che, avendo solo frammenti di dimensione 3, se si vogliono frammenti più grandi bisogna combinare tra di loro vari frammenti piccoli, cosa che, scientificamente, è meno valida. Il secondo (e più grande) problema è che lo strumento Ricostruire non è molto preciso su quali forme scegliere: è sufficiente chiedere frammenti di dimensione 3 e lo strumento li fornisce*. Poi lo strumento è costretto a fare molto lavoro dietro le scene per cercare di rendere inseribili i frammenti nella sezione stabilita.
Qui si possono vedere i frammenti reali che Rebuild sta cercando di inserire (nessun “dietro le quinte” sta lavorando per renderlo adatto) mettendo un punto di taglio ad un'estremità della selezione e disattivando le forze del punto di taglio. Si guardi al risultato qui sotto:

Come si può vedere, questi frammenti non si adattano molto bene. La banda blu rappresenta il divario tra dov’è l’endpoint e dove dovrebbe essere in realtà. L'unico modo per renderli "in forma" richiede di distruggere il frammento originale nel processo.  Lo strumento Remix cerca di risolvere entrambi questi problemi. In primo luogo la biblioteca di frammenti ha frammenti di dimensioni da 3 a 9. Secondo, e più importante, quando si chiede un frammento con Remix, lui cerca un frammento che si inserisca in maniera naturale tra le estremità della selezione.
Ecco alcuni risultati di Remix senza nessuna modifica dopo l’inserimento:

Tutti questi frammenti sono adatti: la fascia gialla mostra che il punto di taglio è già abbastanza vicino da poter essere chiuso. In realtà, abbiamo ancora "corretto" i frammenti di Remix, ma ora hanno solo bisogno di un piccolo aggiustamento, quindi il frammento è lasciato praticamente intatto.
Questo significa che il tool è molto migliore nel lasciare i giocatori con frammenti scientificamente validi.
*Il Rebuild prende la sequenza della dorsale e della struttura secondaria quando si effettua una ricerca, ma non sono disponibili informazioni sulla conformazione.

Usare il nuovo Remix - Mescolare attraverso l’interfaccia grafica
Per usare il Remix su un pezzo di dorsale, selezionare il pezzo e cliccare il bottone Remix (o, nell’interfaccia originale, click con il pulsante destro e poi cliccare sul bottone Remix – apparirà il popup dell’interfaccia Remix).

Si osservi l’interfaccia qui sopra. Innanzitutto ci sono le frecce destra e sinistra: queste permettono di passare attraverso i vari frammenti che Remix ha trovato per questa selezione. E’ possibile vedere quale frammento si sta osservando nella casella di testo sotto i pulsanti. Il primo frammento è sempre quello con cui si parte prima di usare lo strumento Remix e non cambierà nulla della struttura.
Il pulsante di stop serve per accettare il frammento attualmente visualizzato. È inoltre possibile utilizzare il pulsante di arresto nell'angolo superiore sinistro dello schermo e avrà lo stesso effetto.
Accanto al testo che mostra quale frammento si è selezionato, è possibile vedere un punteggio: questo punteggio permette di farsi una idea del punteggio dei frammenti senza dover chiudere lo strumento e scuotere la selezione. Occorre ricordare che questa è solo una stima approssimativa, ed è utile per un confronto relativo dei risultati: il punteggio finale, probabilmente, sarà diverso da quello visualizzato qui.
Infine abbiamo il pulsante “Più”: questo darà l’accesso alla funzionalità di salvataggio. Quando premuto, comparirà questo messaggio.

Dopo aver salvato, si può premere il bottone per tornare al frammento: premendo il pulsante “Più” per un ulteriore frammento, darà la possibilità di un salvataggio veloce nello slot, sovrascrivendo quello esistente. E’ possibile anche premere il pulsante “Stop”(che ha sostituito il “Più”) per cancellare il salvataggio veloce.

Quando si hanno tutti i frammenti desiderati, premere “Stop” e questi frammenti saranno disponibili nello slot per il salvataggio veloce. Cliccare Ctrl-1 e Ctrl-8 per avere accesso.

Rimescolamento via Script
Lo strumento può essere usato anche via scripts. Ecco un breve tutorial di come usarlo:
Per avviare la funzione, usare il comando

structure.RemixSelected(start_quicksave, num_results)

Quando si esegue questa funzione, verrà rimescolata la vostra selezione e posizionata fino al num_results dei diversi risultati nello slot di salvataggio veloce, cominciando uno slot start_quicksave: questo restituirà il numero di risultati che erano stati inseriti (dei volontari ci hanno fatto notare che li avrebbero voluti visibili).
Un esempio:

print(structure.RemixSelected(5, 3))

Se ci sono 3 o più risultati, stamperà “3” e collocherà il risultato negli slot di salvataggio veloce 5,6 e 7. Se ci sono due risultati disponibili, stamperà “2” e il risultato sarà solo negli slot 5 e 6.

Consigli generali
La raccolta di frammenti è utilizzata nel miglior modo per individuare i loop della proteina. Le forme del loop variano molto di più rispetto ad altre strutture secondarie, e quindi trovare un buon loop è più difficile e l'utilizzo di frammenti effettivi da proteine reali diventa più importante.
In generale è meglio usare frammenti più grandi, dal momento che questo offre un pezzo di buona dorsale migliore in una maniera che molti più piccoli rimescolamenti non riescono. Non si faccia troppo affidamento nel punteggio stimato mostrato nell'interfaccia utente Remix: le differenze di meno di 100 punti non sono molto significative.
Nel caso in cui lo strumento non trovi nulla, provare a selezionare un residuo in più o uno in meno in entrambi i lati della selezione: spesso questa mossa sarà sufficiente per dare una migliore gamma di risultati. E’ abbastanza facile farlo nella Interfaccia Selezione, ma richiede che siano riassegnati alcune strutture secondarie nell’Interfaccia Originale.
Alla fine, dopo aver inserito un frammento, ogni cambiamento alla sezione allontanerà dal frammento: è meglio trovare un frammento che richiede modifiche minime al progetto finale.

Il filtro del legame idrogeno
Questo articolo mostra una anticipazione di un filtro bonus in arrivo, il filtro “Rete di legami idrogeno”. Stiamo introducendo questo filtro per superare una grande sfida nel design dell'interfaccia delle proteine, e un qualcosa che abbiamo osservato in molti disegni Foldit. Molti disegni che abbiamo visto finora hanno usato tanti residui idrofobici nelle loro interfacce: questo funziona perché questi residui idrofobici sono “sepolti” nel nucleo del complesso simmetrico, depositati tra due copie della proteina.

Le spirali in blu e bianco mostrano una rete di legami di idrogeno tra tre catene laterali e altre non completamente rappresentati.

Tuttavia, quando si progettano proteine con interfacce, è necessario considerare che l'immissione di questi idrofobici sull'interfaccia significa che questi residui saranno sulla superficie di ciascuno dei singoli pezzi. Questo è un problema perché significa che questi sono esposti in ciascuno dei pezzi isolati, rendendo improbabile che ogni pezzo ripieghi correttamente da solo.
Se i pezzi non si ripiegano da soli, non saranno in grado di interagire tra loro!!
Per risolvere questo problema, i progettisti del Baker Lab hanno utilizzato la “Rete di legami idrogeno”. Una “Rete di legami idrogeno” è una “rete” di legami idrogeno che connette le catene laterali di residui multipli. Quando vengono costruite attraverso interfacce proteiche, queste reti contribuiscono a rendere l'interfaccia più stabile. E’ possibile vedere un esempio di questa rete qui sotto:

E a differenza di un nucleo idrofobo, queste reti possono essere costituite da residui idrofili polari. A causa di ciò, la rete funziona bene come una superficie per ogni pezzo - e funziona ancora bene come un'interfaccia tra i pezzi! L'altro grande vantaggio di queste reti è che aumentano la specificità dell'interfaccia. Poiché le reti sono unite insieme molto attentamente come un puzzle, ogni pezzo sarà più “contento” quando gli sarà consentito di collegarsi in rete con gli altri pezzi.
Ciò aiuta a garantire che i pezzi della vostra proteina si interfaccino tra di loro come avete inteso!

Hydrogen Bonds - Legami idrogeno

I legami di idrogeno sono un'interazione tra un donatore e un accettore: come suggerisce il nome, il donatore cede un atomo di idrogeno, e l’accettore lo accetta. In Foldit, si possono vedere questi donatori e accettatori utilizzando determinate opzioni di visualizzazione disponibili quando si abilita "Mostra Interfaccia avanzata" in Opzioni generali.
Utilizzando lo schema di colori “Score/Hydro+CPK” i donatori saranno blu e gli accettori rossi, come potete vedere nell’esempio sopra. I donatori hanno una carica parziale positiva e gli accettori hanno una carica parziale negativa: questo provoca l’attrazione tra i due. La questione delle cariche opposte non sono tutto: queste cariche sono in collocazioni e direzioni specifiche ed è la geometria del legame idrogeno che impone la sua forza. Per avere un'idea migliore di come migliorare la tua geometria, puoi utilizzare l'opzione “Stick + polarH” in 'Visualizza Proteina'. Questa opzione consente di vedere gli stessi atomi di idrogeno, mostrati in bianco.

Hydrogen Bond Networks - Reti di legami idrogeno

Quando più legami idrogeno si collegano a più catene laterali, formando una rete di idrogeno idonea. Per ottenere del credito per una “rete” in Foldit, devi avere almeno 3 legami di idrogeno e almeno un legame di idrogeno che si collega attraverso un'interfaccia (questi criteri possono cambiare da puzzle a puzzle).
Nei puzzle in cui è il Filtro attivabile, è possibile visualizzare i legami utilizzandolo: a tale scopo, aprire il pannello di filtraggio a discesa sotto il pannello dei punteggi e fare clic sulla casella di controllo "Mostra" per il filtro HBond Network. Le reti valide appariranno come una rete di legami blu. Ogni rete valida che viene formata otterrà un punteggio, che verrà quindi aggiunto al punteggio totale come bonus.
Ma cosa rende “buona” una rete di legami idrogeno?
Beh, in primo luogo, i tuoi legami di idrogeno devono essere buoni: un legame idrogeno debole non funziona per estendere una rete. Bisogna ricordare che la forza di un legame idrogeno dipende dalla sua geometria. Il donatore e l'accettazione devono essere alla distanza e all'angolo giusti per essere abbastanza forti per una rete. Le obbligazioni troppo deboli verranno visualizzate in rosso sulla visualizzazione.

Una volta che hai una rete di buoni legami, il punteggio di una rete idrogeno viene valutato come segue:

Score = SCORE_SCALE * percent_polars_satisfied * num_intermolecule_bonds

Cosa significa?
SCORE_SCALE – E’ solo una costante impostata sulla base del puzzle in uso per decidere quanto valgono le reti idrogeno.
percent_polars_satisfied - Una buona rete di legame di idrogeno minimizzerà il numero di atomi polari non soddisfatti. Se nella rete c'è un atomo blu o rosso, dovrebbe essere legato a qualcosa - in alcuni casi, più volte. E’ corretto che la rete soddisfi la maggior parte o tutti i suoi atomi polari.
num_intermolecule_bonds - Più i legami la rete formerà attraverso le interfacce simmetriche della tua proteina, maggiore sarà il punteggio!
Si possono vedere le statistiche per ogni singola rete, spostandola su uno dei legami di quella rete. Questo evidenzierà anche tutti i legami della rete in giallo:

È importante notare che mentre le reti legami idrogeno sono ottime per stabilizzare l'interfaccia tra le vostre proteine simmetriche, dovrebbero avere anche alcuni residui idrofobici sull'interfaccia. Le soluzioni migliori saranno quelle in equilibrio! Idealmente, si desidererebbe una rete molto connessa e perfettamente soddisfatta, con “imballaggio” idrofobo stretto attorno ad esso.

Foglietti e Barili/Botti

Ci è stato chiesto da alcuni giocatori qualcosa circa i componenti strutturali che differenziano i foglietti beta e le “barili/botti” beta. Questa pagina è per rispondere a queste curiosità.

Conformazione “a botte/barile” della proteina Porina (nella Salmonella)

Domanda da Brow42:
Recentemente abbiamo avuto un puzzle di progettazione che preferiva i foglietti. Alcuni giocatori hanno, poi, fatto un “sandwich” di foglietti e alcuni dei barili beta. Abbiamo tutti fabbricato, alla fine, nuclei idrofobici. Ma quale componente strutturale nelle proteine reali conduce ad una soluzione o all'altra?

Sandwitch Beta (Tenascina-C)

Risposta di bkoep:
Non sono un esperto, ma posso dirti quello che so….e forse posso trovare un altro scienziato del BakerLab che ci segua. In molti barili beta, ci sono posizioni chiave che adottano le conformazioni irregolari della dorsale per rimodellare il foglietto beta. Alcune posizioni adottano un "rigonfiamento beta", in cui un residuo supplementare viene inserito tra due residui di uno filamento beta. Nella sequenza primaria, questo residuo interromperebbe il normale schema dell’alternanza di residui polari e non polari. Ci sono anche posizioni di "Glicine kick" (immagine sotto), in cui un residuo di glicina deforma il foglio beta, adottando una conformazione sfavorevole per altri amminoacidi. Nelle proteine “beta sandwich” (e in molte altre strutture con fogli beta), i "fili sul bordo" di un foglio beta sono spesso bagnati con residui polari sul lato rivolto verso il nucleo del foglietto (normalmente non polare). A volte questi sono residui come il TYR, che ha una regione idrofobica che può contribuire all'imballaggio del nucleo, nonché un atomo polare che può estendersi in solvente per fare legami di idrogeno.

Beta Botte

Completa la risposta Anastassia Vorobieva, PhD:
Come sottolineato da bkoep, la presenza della glicina nel mezzo del foglietto beta (che è raro nei beta “sandwitch”), la posizione di sporgenze e la presenza di residui polari di bordo sono dei buoni criteri di discriminazione tra i sandwich beta e i barili-beta. Tuttavia, non esiste una risposta facile e non abbiamo ancora un'idea chiara di come questi elementi strutturali interagiscano tra loro. Per esempio, rigonfiamenti beta sono presenti in entrambe le conformazioni (botti e sandwitch): solo la loro posizione è importante. E alcune botti beta hanno residui polari nel loro nucleo, in particolare quelli che legano piccole molecole. E per rendere ancora più confusi, alcuni beta-barili sono in grado di richiudersi senza la presenza della glicina nel foglio!
Per andare un po’ più nel dettaglio, i filamenti beta preferiscono avere una torsione destrorsa: in altre parole le catene laterali ei legami di idrogeno tendono a ruotare in senso orario lungo un filamento beta.

Queste torsioni di singoli filamenti provocano beta-foglietti "a forma di ventaglio". Tuttavia, la torsione può essere un vincolo nei fili situati al centro di un foglio, in quanto tali filamenti devono interagire con i fili vicini che hanno la loro propria torsione. Nei barili beta, la curvatura necessaria per richiudere il barile è difficilmente compatibile con la singola torsione dei filamenti beta: di conseguenza, nel barile ci sono alcune posizioni chiave in cui il filamento non può continuare a ruotare a destra e contemporaneamente interagire con i due vicini. Esistono diverse strategie nelle proteine native per "reimpostare" la torsione in tali regioni:
- Posizionare una glicina, che è l'unico residuo che può ruotare a sinistra.
- Posizionare un rigonfiamento, che forzi la rotazione, talvolta, al costo dei legami idrogeno.
- Ridurre il numero di legami idrogeno intra-filamenti. Nei barili che sono in grado di chiudersi senza glicina, i filamenti normalmente interagiscono con un maggiore compenso.
Per progettare le proteine botti beta ab initio, stiamo attualmente lavorando su strategie per prevedere le regioni chiave del foglio, poichè la torsione diventerà un problema. Ecco alcune idee per trovare i problemi di torsione:
- Le catene laterali e i legami di idrogeno ruotano a destra lungo il filamento.
- Se le torsioni di due filamenti vicini non sono coordinate, le catene laterali di due residui interagenti tendono a piegarsi l’una verso l'altra. Quando due vicini di filamenti vicini sono ben “coordinati”, le catene laterali sono parallele tra loro.
- La piegatura delle catene laterali l’una verso l'altra probabilmente provocherà molti problemi nella struttura: queste catene laterali sono probabilmente in conflitto tra loro e la torsione locale della dorsale è sfavorevole. Di conseguenza, il punteggio di Foldit sarà probabilmente influenzato negativamente se si cercherà di forzare la chiusura di un foglio che si ripiegherà più probabile in un sandwich aperto.
Riassumendo, la presenza di glicina e di residui del bordo polari sono delle buone discriminanti tra i barili e i sandwich: se questi non sono sufficienti è necessario cercare gli scontri e i problemi di punteggio che indicano che si sta cercando di forzare la chiusura di un foglio che non vuole essere chiuso. Per quanto riguarda la lunghezza della congiunzione sopra indicata, non dovrebbe avere un'influenza in un foglio correttamente ripiegato, in quanto la torsione della congiunzione è compatibile con la torsione complessiva del filamento.

La progettazione di farmaci: l’aggiornamento dell’interfaccia
La parte del progetto legata al design farmacologico è cominciata qualche mese fa con una interfaccia veramente semplice

L'idea che abbiamo avuto era quella di utilizzare l'interfaccia utente grafica per la progettazione di proteine: nell’immagine qui sopra si vede il menù “Pi” quando si seleziona un atomo da progettare. Mentre questo è un concetto abbastanza buono, il problema principale che abbiamo incontrato era che il menu “Pi” nascondeva il ligando da progettare. Era molto difficile eseguire le modifiche e vederne gli effetti sulla proteina/ligando.
Questa difficoltà ha determinato un passaggio a un menu separato.

In questo menu, che abbiamo chiamato “Pannello di progettazione di Ligandi”, è possibile selezionare gli atomi da progettare e quindi fare clic sul pannello stesso per cambiarli. La cosa fantastica è ora che si può spostare il pannello di progettazione e vedere la proteina e il ligando senza interferire con il menu stesso. Naturalmente ci sono anche alcuni problemi con questo menu: abbiamo alcune opinioni miste e ti invitiamo a condividere i tuoi pensieri nel nostro thread qui sotto.

Gli elementi da scegliere sono solo etichettati con il nome dell'elemento: C-carbonio, N-azoto, O-ossigeno, P-fosforo, ecc. Inoltre i frammenti mostrati sotto gli elementi sono di un colore simile al magenta. Inoltre, quando si fa clic su un atomo, poi su un frammento, non si ha idea di dove sarà collocato quel nuovo frammento, spazialmente: per questo abbiamo avuto bisogno di aggiornare il pannello ligandi. Il nuovo pannello è molto più colorato! Gli elementi sono colorati in base al loro colore CPK e i frammenti sono stati sostituiti con immagini ad alta definizione. Inoltre, ora, quando si seleziona un frammento, un contorno “raggiante” di quel frammento viene disegnata sulla struttura. Non bisogna più tirare ad indovinare dove il frammento sarà collocato!!
Inoltre, abbiamo aggiunto la possibilità di modificare i vincoli e questo ci porta al prossimo miglioramento grafico introdotto. Prima, tutto era mostrato come un legame singolo: ora, la piccola molecola viene disegnata con i suoi legami visibili ed è disponibile un nuovo modo di visualizzare la proteina, chiamata l'”opzione di visualizzazione Cartoon Ligand” (sotto impostazioni avanzate, Proteine vista: Cartoon Ligand).

Abbiamo aggiunto nuovi modi di visualizzare interazioni all'interno della proteina. Abbiamo anche aggiunto un pannello di visualizzazione ligandi, che permette di trasformare l'isosuperficie solo intorno alla piccola molecola, mostrando aree in cui ci sono un accettore / donatore di legame di idrogeno e, infine, dove c'è repulsione tra atomi. È anche possibile modificare al volo la trasparenza di tutto, cosa che consente una più diretta manipolazione delle impostazioni. Infine, abbiamo aggiunto funzionalità che aiutano a farti notare se si sta cercando di progettare qualcosa che non sia chimicamente fattibile.
Ci auguriamo che tutti godano di queste nuove aggiunte; fateci sapere quali altre cose vorreste vedere nel settore grafico.