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In questo articolo, gli sviluppatori di Foldit vogliono dar conto dell’avanzamento dei lavori e delle migliorie introdotte nel gioco, anche grazie all’ausilio dei volontari.

La qualità della catena principale locale
A differenza dei gruppi α-elica, che i giocatori di Foldit hanno padroneggiato con relativa facilità, il design di foglietti α/β si è rivelato molto più problematico. Per un po’ di tempo abbiamo sospettato che il centro del problema fossero delle conformazioni congiunturali locali sfavorevoli.
In particolare, abbiamo rilevato che le proteine α/β, progettate dai volontari, sembravano avere congiunzioni mai viste in proteine naturali.
Il filtro “Ideal Loop/Congiunzione Ideale”, introdotto lo scorso Giugno, ha aiutato in maniera notevole la progettazione in Foldit e, negli aggiornamenti successivi, abbiamo visto un ulteriore miglioramento della qualità della struttura delle proteine progettate dai volontari. Il riquadro di riepilogo qui sotto mostra la deviazione media delle dorsali nelle proteine migliori progettare da Foldit (si immagini di “rompere” ogni proteina progettata in frammenti di 9 residui, cercando per ogni frammento una proteina naturale che abbia un frammento con catena principale simile e quindi misurando l’RMSD alla corrispondenza più vicina. Se ogni frammento di una catena progettata ha una stretta corrispondenza con una proteina naturale, ci dovrebbe essere un RMSD medio basso; se ci sono regioni del design che hanno una catena insolita, quel design avrà un valore RMSD medio maggiore.

Si può vedere come la qualità della catena principale nelle progettazioni Foldit è migliorata in maniera significativa dopo l’imposizione del filtro “Ideal Loop”, disabilitando il “Ricostruisci”, regolando le torsioni “IdealizeSS” e introducendo il pannello “Blueprint”. La linea tratteggiata segna un valore di riferimento rispetto alle proteine progettate con successo dal laboratorio Baker; tutte le proteine progettate da Koga et al. cadono sotto questa linea. Negli ultimi puzzle in cui è stato utilizzato il Blueprint, si nota che la maggior parte dei progetti proteici di Foldit di alta qualità sono anch’essi al di sotto di quella linea.

Gli imbuti (energetici) di ripiegamento di Rosetta@home
Il miglioramento delle catene principali in Foldit si riflette in altri tipi di analisi. Con le dorsali migliorate, infatti, Rosetta@Home è in grado di prevedere meglio la struttura delle proteine progettate in Foldit a partire dalle loro sequenze di aminoacidi (spiegato qui). Di seguito sono riportate alcune proteine dei giocatori di Foldit che sono state ripiegate con successo da Rosetta@home, ma tutte provenienti da puzzle che hanno usato il filtro “Ideal Loop”. La “forte” forma ad imbuto di ogni trama indica non solo che Rosetta è in grado di campionare il ripiegamento desiderato (notare i numerosi punti rossi con RMSD inferiore a 2 Angstrom), ma anche che Rosetta può predire la struttura più stabile. Si confrontino questi modelli con quelli precedenti.

Puzzle 1245

Puzzle 1257

Puzzle 1299

Ognuna delle simulazioni qui sopra è stata traslata inversamente in DNA sintetico, inserito in un organismo E. Coli ed espresso nel nostro laboratorio per ulteriori test. Tuttavia, negli esempi, abbiamo omesso alcuni design particolarmente promettenti, che stanno già mostrando risultati incoraggianti.
Un grosso ringraziamento a tutti i volontari di Foldit che, settimanalmente, ci aiutano a progettare nuove proteine: stiamo imparando molto dai vostri contributi e apprezziamo particolarmente la vostra pazienza e persistenza con i nuovi tools e filtri.

I giocatori entrano nel laboratorio
La scorsa settimana il laboratorio del Baker ha ordinato materiali per costruire l'ultima serie di disegni Foldit in laboratorio per sperimentazioni sperimentali! I seguenti design proteici sono stati selezionati in base all’ispezione visiva dei nostri scienziati e alle previsioni di ripiegamento dal progetto Rosetta@Home.
Per ogni progetto qui sotto abbiamo incluso, a sinistra, l’immagine creata dal giocatore di Foldit; a destra l’imbuto pieghevole con l’energia e l’RMSD del C-alfa per 100 mila secondi sulle previsioni di Rosetta@Home (in rosso), nonché l’immagine della previsione dell’energia più bassa. Ci piace vedere che la previsione dell’energia più bassa ha anche un basso RMSD.

Design di Monomeri
Nel design di monomeri, siamo particolarmente interessati alle diverse topologie contenenti alcuni foglietti beta come strutture secondarie. Queste topologie sono notevolmente più difficili da progettare rispetto ai fasci elicoidali che hanno avuto successo in passato.
Di conseguenza questi imbuti di ripiegamento possono apparire meno puri, ma siamo comunque entusiasti per la sperimentazione in laboratorio!

Design di oligomeri simmetrici
Per la progettazione di omo-oligomeri simmetrici, facciamo una analisi simile per essere sicuri che il monomero si ripieghi come aspettato. Vogliamo anche assicurarci che, una volta ripiegate, le unità monomero si leghino, probabilmente, tra di loro nell'orientamento corretto. Il motivo più comune per cui un progetto non riesce a fare questo test "di ripiegamento" è che la sua interfaccia è completamente idrofobica e priva di caratteristiche. In questo caso, due monomeri opportunamente piegati possono unirsi in diversi modi per coprire la stessa quantità di superficie idrofoba. Il modo migliore per assicurare il legame specifico nell'orientamento corretto è quello di progettare superfici robuste e
complementari (ad esempio grandi catene laterali interdigitate) e, poi, incorporare reti di legami-idrogeno nell'interfaccia.
I seguenti progetti simmetrici sono stati eseguiti in maniera sufficiente per entrambi i test di ripiegamento e docking  dei monomeri (dati non visibili) e siamo ansiosi di provarli – tuttavia pensiamo ci sia ancora spazio per miglioramenti nella progettazione di interfacce specifiche!

I giocatori responsabili dei disegni qui sopra meritano certamente un riconoscimento, ma ci sono vari disegni molto più emozionanti che sono ancora in fase di analisi. Non vediamo l'ora di vedere cosa i giocatori di Foldit riusciranno a far uscire con il prossimo aggiornamento!

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Il grafico di Ramachandran o mappa di Ramachandran (da qui in poi "Rama". NDR) è un modo per esaminare la struttura principale di ogni residuo in una proteina.
Questo metodo è stato usato per la prima volta da  G.N. Ramachandran et al. nel 1963 per descrivere le disposizioni stabili dei singoli residui di una proteina.
Oggi, il grafico di Rama è usato frequentemente dai cristallografi per identificare modelli di proteine con strutture irrealistiche.

Come alcuni di voi possono ricordare, ogni residuo di una proteina ha due legami rotanti, che sono chiamati φ e ψ. Se prendiamo una struttura proteica e misuriamo le rotazioni di questi legami (tra -180 e 180 gradi), possiamo tracciare ogni residuo rispetto al suo φ (asse x) e ψ (asse y). Il risultato è il grafico di Rama, in cui ogni punto nero è un residuo di una proteina:

Alcune rotazioni sono più stabili di altre: le aree bianche del grafico Rama sono instabili e un residuo in questo spazio avrà un cattivo punteggio strutturale;
le aree colorate, invece, sono più stabili e i residui avranno un punteggio migliore.
Le aree stabili del grafico Rama in Foldit sono divise in quattro regioni, chiamate regioni ABEGO, e sono colorate in questa maniera:
* Rossa: elica ad andamento destrorso (caratteristica di una α-elica)
* Blu: filamento destrorso (caratteristico del filamento β)
* Verde: elica ad andamento sinistrorso (poco comune, eccetto che per la glicina)
* Gialla: filamento sinistrorso (molto poco comune, eccetto che per la glicina)

Poiché i 20 diversi tipi di amminoacidi hanno proprietà diverse, ogni tipo di amminoacido ha un “profilo Rama” leggermente diverso. Per esempio, la maggior parte degli amminoacidi ha una catena laterale che si “scontra” con la dorsale principale nell’elica sinistrorsa, di modo che le mappe di questi residui hanno solo una debole area verde. Diversamente, la glicina non ha alcuna catena laterale e può facilmente adottare una conformazione a forma di elica a sinistra, quindi la sua mappa ha una grande, intensa zona verde.
Muovendo il mouse sopra un punto nella mappa di Rama per vedere il suo tipo e il numero di residui nell’angolo in alto a destra; cliccando su un punto è possibile vedere il profilo Rama specifico per il suo tipo di amminoacido (questo è anche il residuo nella “Selection Mode”). Cliccando e trascinando un punto, si cambiano le rotazioni ? e ? della struttura dorsale di un singolo residuo. La finestra di visualizzazione nella parte alta della mappa Rama si concentrerà sul residuo selezionato e, semplicemente, mostrerà la configurazione locale della dorsale proteica intorno al residuo. Ogni residuo nella visualizzazione è colorato secondo la regione ABEGO in cui si trova. Lo schema di colorazione ABEGO può essere applicato anche alla console principale di Foldit nelle opzioni di visualizzazione con Visualizza-> AbegoColor.

Le "Congiunzioni ideali"
Durante la progettazione di una proteina ci sono una serie di diverse dorsali che possono connettersi con le α-eliche e i foglietti-β. Tuttavia abbiamo riscontrato che determinati tipi di congiunzioni si verificano di frequente nelle proteine native e che queste “congiunzioni ideali” possono essere distinte dai modelli ABEGO. Per esempio, il modo più comune di connettere due filamenti β è una breve “forcina”

con due residui nella conformazione a spirale sinistrorsa (verde).

La mappa di Rama in Foldit include una galleria di congiunzioni ideali, collocata nel menù a tendina in alto a destra. Ogni menù mostra una manciata di questi congiunzioni, che possono essere usate per connettere alcune combinazioni di eliche alfa e filamenti beta; le congiunzioni sono fornite come riferimento ai giocatori di Foldit e li incoraggiamo a provare ad incorporare queste nelle strutture che stanno progettando. All’interno di ciascun menù, le congiunzioni più comuni sono elencate nella parte superiore, ma un congiunzione meno comune può essere “preferita” a seconda del layout preciso di eliche alfa e foglietti beta di un progetto.
La mappa Rama sarà disponibile per l’uso solo in puzzle selezionati: per accedervi basterà andare sul menù “Azioni” nell’interfaccia nativa o su “Selezione Interfaccia” nel menù principale.

La storia del design proteico in Foldit

Come discusso in un precedente post , alcune soluzioni dei giocatori di Foldit ricavate da un puzzle sono state scelte per la sintesi nel laboratorio Baker. Un design in particolare, dal puzzle 854, ha recentemente prodotto alcuni risultati promettenti nel “laboratorio umido”. Qui sotto seguiamo il processo di test.

1. Una volta selezionato il design da sintetizzare in laboratorio, ne estraiamo la sequenza di aminoacidi e ne facciamo una trascrizione inversa in una sequenza di basi DNA (un gene, per esempio), aggiungendo un “tag” speciale che ci sarà utile più avanti.

2. Noi ordiniamo questo gene come una molecola di DNA da un gruppo di sintesi del gene, e uniamo il gene in un pezzo circolare più grande del DNA chiamato plasmide. Il plasmide, che ora contiene il nostro gene, è inserito nei batteri E. coli, che possiamo far crescere e riprodursi in un incubatore. Questi batteri trascrivono e traducono il nostro gene come se fosse uno dei loro, producendo il nostro design come una catena di polipeptidi; se il disegno della proteina è “buono”, la catena del polipeptide si ripiegherà naturalmente nella struttura di progettazione.
3. Una volta che i batteri sono cresciuti fino alla saturazione e producono una grande quantità di proteine, “apriamo” le cellule batteriche e separiamo la nostra proteina da quelle dell’E.Coli, usando il tag speciale che abbiamo inserito nel passaggio 1. A questo punto, possiamo vedere se i batteri sono stati in grado di produrre la nostra proteina e se essa è solubile. Le proteine non strutturate, di solito, saranno degradate dall’E. Coli o saranno in forma insolubile.

SDS-PAGE. Un campione di proteine mescolate (blu colorato) viene passato attraverso un gel di poliacrilamide dall'alto verso il basso, in modo che le proteine più piccole si muovano più velocemente attraverso il gel. Qui sono mostrati tre campioni: tutte le proteine solubili da un batterio (sinistra), proteine che non hanno il tag speciale che abbiamo inserito nello step1 (in mezzo) e le proteine con il tag speciale (destra). Anche se i primi due campioni hanno molte bande (diverse proteine) che si diffondono lungo la lunghezza del gel, il campione a destra è “dominato” da una singola grande macchia (la nostra proteina) vicino alla parte inferiore del gel.

4. Usiamo la cromatografia di esclusione molecolare (SEC), che separa le proteine in base alla loro dimensione, per liberarsi di altre impurità proteiche. Questo passaggio ci fornisce anche informazioni sullo stato oligomerico delle nostre proteine (le proteine instabili con residui idrofobici esposti tendono ad auto-associarsi in oligomeri). I monomeri strutturati si comporteranno in modo diverso sulla colonna rispetto agli oligomeri o agli aggregati non strutturati.

Traccia SEC. Le proteine sono fatte passare attraverso una matrice tale che le proteine più grandi percorrano più velocemente la stessa, e vengano “raccolte” prima (all’estremità sinistra dell’asse delle x); l’assorbanza dei raggi UV è usata per misurare la concentrazione proteica (asse delle y) dei campioni così come vengono raccolti. E’ possibile notare che, nel caso della nostra proteina, questo passaggio non fosse strettamente necessario, dal momento che la proteina era insolitamente pura, evidenziata da un solo picco dominante a 14ml. Infatti, il posizionamento a 14ml corrisponde esattamente alla dimensione prevista dal design, indicando che la proteina è monomerica.

5. Dopo aver purificato la nostra proteina, possiamo usare il dicroismo circolare (CD) per misurare la sua struttura secondaria. Questa tecnica misura l’assorbimento, da parte di una proteina, della luce polarizzata circolarmente e può dirci, all’incirca, la quantità di α-eliche o di β-foglietti in una proteina. Questa misura, inoltre, permette di monitorare come la proteina si dispieghi con l’aumentare della temperatura.

Dicroismo Circolare. Differenti elementi della struttura proteica interagiscono in maniera diversa con la luce polarizzata circolare. A 25 gradi centigradi (traccia blu, in alto) la nostra proteina mostra un DC tipico di una proteina con un notevole contenuto di α-eliche. A 95 gradi (traccia roda, in alto), la forma del profilo è meno evidente, ad indicare una perdita di struttura secondaria; struttura secondaria che viene “recuperata” tornando a 25 gradi (traccia verde, in alto). La traccia inferiore mostra come il segnale del DC a 220 nm cambi quando viene aumentata la temperatura del campione proteico. Il passo graduale di questa traccia indica uno sviluppo non cooperativo e multi-stato.

La proteina sopra è in fase di preparazione per la cristallizzazione. Se riuscisse, potremmo ottenere una struttura cristallina ad alta definizione della proteina e fare un confronto con la proteina progettata.